De kwalificatie voor de Gran Premio D'Italia Brembo leek een uitgemaakte zaak voor Pecco Bagnaia, die hier de afgelopen twee jaar al onnavolgbaar is geweest en op vrijdag in de time-attack een behoorlijke tik had uitgedeeld, door als enige onder de 1'45 door te gaan - bijna 3 tiende seconde sneller dan Alex Rins die heel verrassend de tweede tijd had gezet.
In Q1 bleek echter dat de tijden dit jaar beduidend sneller zijn. Met een 1'44.868 zette Raul Fernandez de snelste tijd van het weekend en ging daarmee onder de tijd die Bagnaia op vrijdag had gezet, waarna Franco Morbidelli voor eigen publiek een nieuw absoluut ronderecord van 1'44.726 reed.
Niemand die daarna in staat was om die tijd te verbeteren, Brad Binder zette in zijn tweede run nog wel een 1'44 op de klok, maar kwam 0,126 seconde op een plekje in Q2 te kort. Jack Miller reed slechts de 9e tijd, terwijl wildcard Pol Espargaro in zijn tweede run crashte, waardoor geen enkele van de Red Bull KTM Factory Racing machines toegang kreeg tot Q2, met Pedro Acosta de enige KTM RC16 in Q2.
De start van Q2 had de eerste ronde uit de pits veel weg van het gedrag waar in de Moto3 tegenwoordig straffen worden uitgedeeld. Marquez lag voor Acosta en Martin, maar had geen zin om als sleepje te dienen en ging voor de bocht waar Bagnaia z'n 3-grid penalty kreeg van het gas. Een verraste Acosta reed vlak langs Marquez af en deed op zijn beurt daarna meteen het gas dicht, om Marquez weer voorbij te laten gaan.
Uiteindelijk trok Acosta aan het kortste eind, maar zette desondanks in zijn eerste vliegende ronde de derde tijd achter de voor hem rijdende Franco Morbidelli en Raul Fernandez, die de eerste en tweede tijd noteerden, waarna Marc Marquez ruim 3 tiende seconde onder de tijd van Morbidelli ging.
Het was echter Jorge Martin die optimaal profiteerde van het sleepje van Marc Marquez en vanuit de slipstream op het rechte stuk met 1'44.504 een halve seconde onder Marquez' tijd door ging - twee tiende sneller dan het record dat Morbidelli in Q1 had gezet. Pecco Bagnaia leek in zijn eerste vliegende ronde onder de tijd van Martin door te gaan, maar gaf in de laatste sector tijd toe en gaf daardoor 43 duizendste seconde op de tijd van Martin toe.
Waar door de meesten er nog een tweede ronde aan vast werd geplakt dook Bagnaia meteen in de pits, had daardoor vrij baan in zijn tweede run en leek daar optimaal van te profiteren, maar gaf in zijn eerste vliegende ronde opnieuw in de laatste sector toe. In zijn tweede vliegende ronde maakte hij daarna een klein foutje, waardoor de pole position buiten bereik was.
Marc Marquez daarentegen was bezig aan een ijzersterke tweede run en zat na twee sectoren al een kwart seconde onder de tijd van Martin, maar ging daarna over het voorwiel onderuit. Dat verstoorde ook de snelle ronde van Martin, die eveneens niet meer in staat was om zijn eigen tijd aan te scherpen, maar de pole position ook niet meer in gevaar zag komen.
MotoGP Mugello, uitslag kwalificatie:
| Rijder | Team | Merk | Tijd | Verschil | |||
| 1 | Jorge Martin | ESP | Prima Pramac Racing | Ducati | Q2 | 1'44.504 | |
| 2 | Pecco Bagnaia | ITA | Ducati Lenovo Team | Ducati | Q2 | 1'44.547 | +0.043 |
| 3 | Maverick Viñales | ESP | Aprilia Racing | Aprilia | Q2 | 1'44.687 | +0.183 |
| 4 | Marc Marquez | ESP | Gresini Racing MotoGP | Ducati | Q2 | 1'44.784 | +0.280 |
| 5 | Enea Bastianini | ITA | Ducati Lenovo Team | Ducati | Q2 | 1'44.880 | +0.376 |
| 6 | Franco Morbidelli | ITA | Prima Pramac Racing | Ducati | Q2 | 1'44.896 | +0.392 |
| 7 | Pedro Acosta | ESP | RED BULL GASGAS TECH3 | KTM | Q2 | 1'45.028 | +0.524 |
| 8 | Alex Marquez | ESP | Gresini Racing MotoGP | Ducati | Q2 | 1'45.208 | +0.704 |
| 9 | Aleix Espargaro | ESP | Aprilia Racing | Aprilia | Q2 | 1'45.236 | +0.732 |
| 10 | Alex Rins | ESP | Monster Energy Yamaha MotoGP | Yamaha | Q2 | 1'45.296 | +0.792 |
| 11 | Miguell Oliveira | POR | Trackhouse Racing | Aprilia | Q2 | 1'45.377 | +0.873 |
| 12 | Raul Fernandez | ESP | Trackhouse Racing | Aprilia | Q2 | 1'45.458 | +0.954 |
| Q1 | |||||||
| 13 | Brad Binder | RSA | Red Bull KTM Factory Racing | KTM | Q1 | 1'44.994 | +0.268 |
| 14 | Fabio Di Giannantonio | ITA | Pertima Enduro VR46 Racing Team | Ducati | Q1 | 1'45.007 | +0.281 |
| 15 | Fabio Quartararo | FRA | Monster Energy Yamaha MotoGP | Yamaha | Q1 | 1'45.076 | +0.350 |
| 16 | Marco Bezzecchi | ITA | Pertima Enduro VR46 Racing Team | Ducati | Q1 | 1'45.218 | +0.492 |
| 17 | Joan Mir | ESP | Repsol Honda Team | Honda | Q1 | 1'45.728 | +1.002 |
| 18 | Johann Zarco | FRA | LCR Honda Castrol | Honda | Q1 | 1'45.813 | +1.087 |
| 19 | Jack Miller | AUS | Red Bull KTM Factory Racing | KTM | Q1 | 1'45.824 | +1.098 |
| 20 | Augusto Fernandez | ESP | Tech3 GASGAS Factory Racing | KTM | Q1 | 1'45.893 | +1.167 |
| 21 | Pol Espargaro | ESP | Red Bull KTM Factory Racing | KTM | Q1 | 1'45.943 | +1.217 |
| 22 | Lorenzo Savadori | ITA | Aprilia Racing | Aprilia | Q1 | 1'46.200 | +1.474 |
| 23 | Takaaki Nakagami | JPN | LCR Honda IDEMITSU | Honda | Q1 | 1'46.265 | +1.539 |
| 24 | Luca Marini | ITA | Repsol Honda Team | Honda | Q1 | 1'46.698 | +1.972 |